DR
Wed 13 December 2006, 01:05 pm GMT +0100
OŠTEĆENJE ĆELIJE, SMRT i ADAPTACIJA
Ćelija i okruženje
Adaptivni odgovor: atrofija, hipertrofija, hiperplazija, metaplazija. Oštećenje ćelije: reverzibilno, ireverzibilno. Delovanjem etioloških faktora - oštećenja građe subcelularnih struktura i poremećaja njihove funkcije.
Stepen oštećenja ćelije zavisi od: vrste etiološkog faktora, intenziteta i dužine njegovog dejstva, tipa ćelije (tj. od njene osetljivosti - vulnerabilnosti na dejstvo etio¬loš¬kog agensa), drugih faktora (npr. pro¬krvljenosti i nutricionih karakte¬ris¬tika zahvaćenog tkiva).
Oštećenja: biohemijska oštećenja, morfološke promene na pojedinim organelama ili u citoplazmi, mogu biti: reverzibilne ili ireverzibilne
Smrt ćelije: nekroza, apoptoza
(+ slika slajd 9)
Uzročnici oštećenja ćelije:
1. Hipoksija; 2. Fizički agensi (mehanička trauma, opekotine, smrzotine, iznenadne promene pritiska – barotrauma, zračenje, električni šok); 3. Hemijski agensi (glukoza, so, voda, otrovi – toksini, lekovi, insekticidi, herbicidi, CO, azbest, alkohol, duvan, narkotici); 4. Infektivni agensi (prioni, virusi, rikecije, bakterije, gljive, paraziti); 5. Imunske reakcije (reakcije preosetljivosti, autoimunske reak¬cije); 6. Abnrmalno nakupljanje metaboličkih produkata (npr. slobodnih radikala kiseonika);
7. Ge¬¬netske promene (kongenitalne malformacije, abnormalni proteini – hemoglobinopatije, abnor¬manost ili nedostatak enzima); 8. Nutricioni disbalans (proteinsko-kalorijske deficijencije, vitaminske deficijencije, prekomerni unos hrane – gojaznost, ateroskleroza)
Najčešća inicijalna oštećenja ćelija:
1. Integritet ćelijske membrane; 2. Aerobno disanje (promene u ATP sintezi utiču na pH, influks Ca++); 3. Sinteza proteina - smanjena sinteza proteina citoskeleta, bubrenje ćelijske (membrane);
4. Genetski aparat Npr. oštećenje DNK zračenjem: može da ostane neprimetno do deobe ćelije; prvo se vidi na ćelijama koje se brže dele). 5. Smanjena sinteza ATP u mitohondrijama - smanjena aktivnost Na+/K+ ATPaze: ćelija zadržava Na+ i H2O i bubri; nagomilava se mlečna kiselina, razvija se acidoza; lipidi se nagomilavaju u ćeliji (specijalno u ćelijama jetre izazivajući cirozu).
MEHANIZMI OŠTEĆENJA ĆELIJE
Ishemija; Reaktivni oblici kiseonika (O2.-, H2O2, OH.): radiacija; inflamacija; hemijski faktori; reperfuziono oštećenje (+sličica, slajd 15)
Ishemija i hipoksija
Reverzibilno oštećenje
Smenjena oksidativna fosforilacija:
• Smanjeno stvaranje ATP-a, a povećana koncentracija ADP-a, AMP-a i neorganskog fosfata: # AMP/ATP # aktivnosti fosfofruktokinaze # razlaganje glukoze do piruvata; Istovremeno se zbog manjka kiseonika # koncentracija NADH (izostaje njegova oksidacija u mitohondrijama) i on # prelazak piruvata u laktat što, $ pH. faza brze glukolize 2min., a zatim faza spore glukolize zbog inhibitornog delovanja niskog pH i NADH;
• Smanjena aktivnost Na+/K+ pumpe (aku¬mu¬lacija Na+ u ćeliji, isoosmotsko zadr¬ža¬vanje vode (edem), povećana konc Ca++ u citoso¬lu, difuzija K+ iz ćelije);
• Povećana c. Ca++ u citosolu - Izvori: mito¬¬hon¬drije, ER, vanćelij¬ski. Posledice: 1. Ca++ ulazi u mitohondrije i uzrokuje stvaranje pora u mitohondrijskoj mem¬bra¬ni (perme¬abi¬litetna tranzicija). Us¬pos¬ta¬vi li se normalna oksigenacija, mito¬hon¬¬drije počinju da proizvode ATP, pore se zatvaraju i popravlja se funkcija mito¬hon¬drija, a oporavljena proizvodnja ener¬gije oporavlja i druge ćelijske funkcije; 2. Aktivacija enzima (ATPaza: ↓ATP, fosfolipaza: ↓ fosfolipidi); aktivacija en¬zi¬ma, fosfolipaze, aktivacija membranskih fosfolipaza A1 i A2: otcepljuju se masne kiseline, medju kojima je i arahidonska kiselina, arahidonska kiselina se metaboliše ciklooksigenaznim / lipo¬oksi¬genaznim putem, pri čemu nastaju slobodni radikali kiseonika (*); Aktivira se fosfolipaza C koja pokreće fosfoinozitolski glasnički put, pri čemu nastaju diacilglicerol i inozitol-trifosfat koji povećavaju koncentraciju Ca++ (delujući na prenosne mehanizme u membranama ćelije i ER), Ca++ koji se u početnoj reverzibilnoj fazi nakupio u mitohondrijama sad izlazi napolje dalje povećavajući koncentraciju Ca++; Endonukleaze: oštećenje jedarnog hromatina, proteaze: razgradnja proteina membrane i proteina citoskeleta; aktivira se enzim - proteaza koja na odredjenom mestu razlaže enzim ksantin-dehidrogenazu i prevodi ga u ksantin-oksidazu, ksantin-dehidrogenaza, pri oksidaciji hipoksantina i ksantin, prenosi elektrone i vodonik na NAD, a ksantin-oksidaza prenosi elektrone na molekulski kiseonik i tako nastaje O2-., koji u prisustvu tragova Fe++ prelazi u H2O2, a ovaj u hidroksilni radikal (OH.); u nervnim i endotelnim ćelijama: podstiče aktivnost NO sintaze, pa se povećava stvaranje NO, koji deluje citotoksično prelaskom u peroksinitritni anjon i dalje stvaranjem OH.)
Biohemijske promene: anaerobnapovećana glikoliza (deplecija glikogena, akumulacija laktata, akumulacija neorganskih fosfata, ↓ pH intracelularno);
Morfološke promene
• Odvajanje ribozoma: smanjena proteina
• Pogoršanje funkcije mitohondrija
• Povećanje permeabilnost membrane
• Disperzija citoskeleta: gubitak mikrovila,
stvaranje evaginacija ćelijske membrane
• Bubrenje mitohondrija, ER i cele ćelije.
(*) Slobodni radikali kiseonika koji nastaju tokom hipoksije u reverzibilno oštećenim ćelijama deluju kao glasničke molekule i podstiču aktivaciju sistema NF-kB (nuklearni faktor kB). Transkripcioni faktor NF-kB se nalazi u citoplazmi različitih ćelija vezan za inhibicijski molekul I-kB. Aktivacijske poru¬ke (IL-1, TNF-a, H2O2, virusi, LPS bakterija) podstiču odvajanje I-kB, a nakon toga oslobodjeni NF –kB putuje u jedro i vezuje se za pobudjivače gena koje aktivira (kortizol potiskuje aktivnost NF –kB). Geni koje NF–kB aktivira kodiraju sintezu proteina koji neposredno, ili putem posrednika, učestvuju u lokalnoj inflamatornoj reakciji i opštoj reakciji organizma na oštećenje. [centralni dogadjaj u aktivaciji endotelnih ćelija i vodijePobuda NF –kB povećanoj ekspresiji adhezivnih molekula i adheziji leukocita za endotel (aktivacijom leukocita oslobadja se velika količina slobodnih radikala)]
Ireverzibilno oštećenje:
Morfološke promene:
• Mitohondrijske promene (izražena vakuolizacija; amorfna, kalcijumom-bogata zgusnuća)
• Ekstenzivna oštećenja plazma membrane
• Prominentno bubrenje lizozoma koje vodi njihovoj rupturi i ‚‚curenju‚‚ degradativnih enzima (aktivacija kiselih intracelularnog pH, sa degradacijom ćhidrolaza zbog elijskih komponenti)
• Promene u jedru (kondenzacija – piknoza i fragmentacija – karioreksa, ili razgradnja - karioliza)
• Kontinualni gubitak ćelijskih proteina, enzima, koenzima, RNK i dr. metabolita
• „Curenje“ enzima merljivo u serumu – dijagnostički značaj (*iz ćelija srčanog mišića oslobadja se CK i troponin, * iz ćelija srčanog mišića i jetre oslobadja se AST (SGOT), *iz ćelija jetre se oslobadja ALT (SGPT), ** AST i ALT - aminotrnsferaze)
• Influks makromolekula iz intersticijuma
Mehanizam ireverzibilnog oštećenja:
Fenomeni koji karakterišu ireverzibilnost: nesposobnost reverzije disfunkcije mitohondrija; duboki poremećaji funkcije plazma membrane (jedan od glavnih faktora).
Mitohondrije: su energetske fabrike eukariotskih ćelija; Imaju dve membrane - spoljašnju i unutrašnju koja je nabrana tako da formira kriste. Enzimi koji učestvuju u ciklusu limunske kiseline (Krebsov ciklus ili TCA ciklus) su locirani u mitohondrijama; Ovi enzimi učestvuju u degradaciji razgradnih produkata proteina, šećera i masti do CO2 i H2O, pri čemu se osobadjaju visoko-energizovani elektroni koji se prenose na proteine respiratornog lanca lokalizovane na unutrašnjoj membrani, gde se njihova energija prenosi na ATP (poslednje 2 fosftne grupe ATP-a su vezane za ostatak molekule specijalnim energijom bogatim hemijskim vezama – energija pohranjena u ovim vezama oslobadja se njihovom razgradnjom za ćelijke potrebe, kao što je kretanje, izbacivanje soli, ingestija nutrijenata itd.); Ovaj proces je aeroban – zahteva kiseonik. Kiseonik je potreban da primi elektrone koji su preneti na respiratorni lanac. Elektroni se kombinuju sa kiseonikom (O2) i protonima (H+) stvarajući vodu; Ako nema kiseonika ćelija stvara ATP iz glukoze anaerobnim putem; Ovaj process je znatno manje efikasan nego aerobna glikoliza i njegov krajnji produkt - mlečna kiselina može da bude štetan po ćelije. (U trkača na duge staze mogu da se jave grčevi u mišićima zbog nedovoljnog snabdevanja kiseonikom i stvaranja velikih količina mlečne kiseline).
Plazma membrana:dvoslojna, izgradjena od fosfolipida – lipida koji čine njen unutrašnji deo i koji su povezani sa negativno naelektrisanim fosfatnim grupama koje su okrenute ka spoljašnjoj sredini i unutrašnjosti ćelije. Okružuje i štiti ćeliju i kontroliše njenu unutrašnjost tako što: 1) kontroliše ulazak vode, soli i nutritienata i 2) interreaguje sa spoljašnjom sredinom posredstvom ćelijskih receptora. Proteini su uronjeni u fosfolipidni dvosloj plazma membrane. Ovi proteini imaju obično jedan eksterni domen, transmembranski domen, i jedan citoplazmatski domen. Ovi proteini služe kao most izmedju unutrašnjosti ćelije i spoljašnje sredine. Neki od ovih proteina su receptori, koji vezuju specifične supstance iz spoljašnje sredine – ligande (receptor i ligand odgovaraju jedan drugom kao brava i ključ i kada se ligand veže za receptor emituje se signal u unutrašnjost ćelije koji može da uzrokuje nastanak promena u ćeliji omogućavajući joj da se adaptira na promene u okruženju). Neki od ovih proteina služe kao adhezivni molekuli, posredstvom kojih se medjusobno povezuju ćelije (npr., epitelne ćelije) ili se ćelije vezuju za proteine bazalne membrane (epitelne ćelije) ili strome (mezenhimske ćelije).
Potencijalni uzroci oštećenja membrane:
• Progresivan gubitak fosfolipida ćelijske membrane: aktivacija fosfolipaza; redukovana sinteza fosfolipida
• citoskeletne abnormalnosti: aktivacija proteaza, bubrenje ćelije
• toksični kiseonični radikali (naročito nakon uspostavljanja protoka krvi)
• Razgradni produkti lipida (nastali degradacijom fosfolipida) imaju detergentni efekat na membranu
• Masivni influks Ca++
+ slika slajd 46
Slobodni radikali kao medijatori oštećenja ćelije
Reaktivni oblici kiseonika (ROS)
• Molekuli kao H2O2 (5)
• Joni kao hipohloridni jon (6)
• Radikali kao hidroksilni radikal (3) – najreaktivniji
• Superoksidni anjon koji je jon i radikal (2)
Radikali – takodje poznati kao SLOBODNI RADIKALI su atomi/ klasteri atoma od kojih jedan sadrži 1 nesparen elektron u spoljašnjoj orbiti, tako da je ovakva konfiguracija izrazito nestabilna, pa brzo reaguje sa drugim molekulima ili radikalima u cilju uspostavljanja stabilne konfiguracije od 4 para elektrona u spoljašnjoj orbiti (1. za vodonik)
Slobodni radikali učestvuju u: ubijanju mikroba u fagocitima; hemijskom i radijacijskom oštećenju; toksičnom delovanju kiseonika i drugih gasova; starenju ćelije; inflamatornom oštećenju; makrofagnoj destrukciji tumora; drugim
Izvori slobodnih radikala:
• Neizbežni produkti ćelijskog disanja (neki elektroni pri prelasku na respiratorni lanac “iscure” sa glavnog puta (specijalno oni koji se prenose ubikvinonom) i odlaze direktno da redukuju molekule kiseonika u superoksidni anjon
• Nepotpuna redukcija kiseonika (ovome pogoduju hipoksija i hiperoksija)
• Reakcije katalizirane: enzimima (ksantin-oksidaza, NADPH oksidaza u neutrofilima i makrofagama i mijeloperoksidaza u neutrofilima); metalima (Fentonova reakcija)
• Metabolizam: Egzogenih molekula (CCl4 konverzija u CCl3), Endogenih molekula (sinteza prostaglandina, aktivnost citohroma P-450)
• Radioloza vode u OH. i H.
Mehanizmi oštećenja slobodnim radikalima:
1. Lipidna peroksidacija membrane (povećana permeabilnost): Dvostruke veze u polinezasićenim lipidima. Među najznačajnije efekte slobodnih radikala ubrajaju se oni koji nastaju njihovim delovanjem na masne kiseline bočnih lanaca lipida različitih membrana ćeli¬je, pre svega membrane mito¬hon¬drija (direktno eksponirana O2. nastala prili¬kom ćelijskog disanja). Na slici je pri¬ka¬zan najverovatniji sled događaja: hidro¬ksilni radikal uklanja H atom sa jednog od C atoma masne kiseline bočnog lanca lipida (prikazan samo deo lanca) formirajući jedan molekul vodonik peroksida i ostavljajući C atom sa jednim nesparenim elektronom (carbon-centred radical) koji može da reaguje sa molekulom kiseonika formirajući peroksilni radikal, koji sad može da „ukrade“ jedan H atom iz obližnjeg lanca stvarajući tako jedan novi radikal. Jedna od podmuklih karakteristika slobodnih radikala je ta što oni interreaguju sa drugim molekulima da bi postigli stabilnu konfiguraciju elektrona i tom prilikom konvertuju taj target molekul u radikal. Tako započinje lančana reakcija koja se propagira sve dok se nesretnu dva radikala, koja dajući po jedan elektron oforme kovalentnu vezu kojom se povezuju. Dva česta primera: Peroksilni radikal može da interreaguje sa: 1.) drugim peroksilnim radikalom na obližnjem bočnom lancu masnih kiselina lipida unakrsno ih vezujući kovalentnim vezama. 2.) Drugim obližnjim ugljeničnim radikalom (carbon-centred radical) unakrsno ih vezijući. U oba slučaja ovako se završava formiranje radikala, ali rezultat je taj da masne kiseline bočnog lanca membranskih lipida postaju tako izmenjene da dolazi do oštećenja membrane. Lipofuscin pigment karakterističan za ostarele ćelije verovatno nastaje ovim mehanizmom.
2. Lezije DNK (smanjena sintezaproteina). Reakcije sa timinom sa prekidima jednog lanca (proteina).
3. „Cross-linking“ proteina (oštećenja jonske pumpe, transportnih mehanizama); sulfhidrilno posredovana unakrsno vezivanje proteina
*Slobodni radikali - nestabilni, spontano degradiraju. Degradaciju ubrzavaju superoksid dismutaza (konvertuje 2 O2.- → u molekul O2 i H2O2) i katalaza (konvertuje H2O2 → O2 + H2O)
Antioksidansi
Antioksidansi mogu uklanjati slobodne radikale (vitamin C, E, flavonoidi, fenoli, karotenoid, mokraćna kiselina, koenzim Q, tiolne molekule: cistein, cistamin, metionin, glutation, ubikvinon) ili mogu blokiraju stvaranje slobodnih radikala (ceruloplazmin, feritin). I neke egzogene molekule mogu u ćeliji delovati kao antioksidansi (diferioksamin).
Smatra se da je visok nivo mokraćne kiseline odgovoran za dug život nekih reptila i ptica. Čovek takodje izlučuje mokraćnu kiselinu (nastaje u peroksizomima kao reziltat metabolizma nukleinskih kiselina, a ne proteina).
Peroksizomi su veličine lizozoma (0.5–1.5 µm), i slično lizozomima, obavijeni jednoslojnom membranom. Slični su lizozomima i jer su bogati enzimima. Za razliku od lizozoma koji nastaju od Godži aparata, peroksizom ovi nastaju od endoplazmatskog retikuluma. Enzimi i proteini peroksizoma se sintetišu u citosolu. Svaki protein sadrži jedan peroxisomal targeting signal (PTS) kojim se vezuje za receptorni molekul koji obezbedjuje ulazak proteina u peroksizom, a potom se “vraća” po novi protein. Dva PTS su identifikovana: 9-amino kiselinska sekvenca na N-terminalnom delu proteina i tripeptid na C-terminalnom delu. Svaki od ova dva PTS ima svoj receptor. Neke od funkcija peroksizoma u ćelijama jetre čoveka su: 1) Razgradnja (oksidacijom) viška masnih kiselina; 2) Razgradnja H2O2, potencijalno opasnog produkta oksidacije masnih kis; 3) Uloga u sintezi holesterola (jedan od enzima koji je uključen je HMG-CoA reduktaza, target lekova za snižavanje nivoa holesterola - statina 3) Uloga u sintezi žučnih soli; 4) Uloga u sintezi lipida koji se koriste za sintezu mijelina; 5) Uloga u razgradnji viška purina (AMP, GMP) do mokraćne kiseline.
Bolesti u čijem nastanku učestvuju slobodni radikali:
Promene u starenju; Ateroskleroza; Moždani poremećaji (Alchajmerova bolest); Kancer; Srčana miopatija; Hronični glomerulonefritis; Dijabetes; Očni poremećaji (katarakta); Inflamatorni poremećaji; Inflamatorne bolesti; Plućne bolesti (emfizem); Kožne promene (izazvane sunčanjem); Nutricioni deficiti; Radijacione povrede; Reperfuzioni sindrom; Toksična stanja.
Uloge ROS u ćeliji
U ćelijama tireoidne žlezde H2O2 je neophodan da veže atome joda za tireoglobulin u sklopu sinteze tiroksina. Makrofage i neutrofili stvaraju ROS kako bi ubile neke tipove bakterija koje unose fagocitozom: bakterija uneta u ove ćelije fagocitozom nalazi se u fagozomu, fagozom sa bakterijom se spaja sa lizozomom, subjedinice enzima NADPH oksidaze se povezuju u membrani lizozoma čime nastaje aktivni enzim koji katalizuje sintezu O2. (NADPH − 2 e- + 2O2 -> NADP+ + H+ + 2 O2−) Ova aktivnost uzrokuje veliku potrošnju kiseonika,-“respiratorna eksplozija” (engl. "respiratory burst"), SOD konvertuje O2− . u H2O2, koji ubija bakterije (sem onih koje produkuju dovoljno katalaze da se zaštite). Neutrofili (ne makrofage) takodje ubijaju fagocitovane bakterije, ali uz učešće enzima mijeloperoksidaze koji katalizuje reakciju izmedju H2O2 (nastalog iz O2− .) i hlorida kojom nastaje jak antiseptik hipohloritni jon (OCl−).
H2O2 + Cl− → HOCl (hipohlorna kiselina) + OH−
HOCl → H+ + OCl−
Hronična Granulomatozna bolest
Redak genetski poremećaj (uzrokovan defektom gena na X hromozomu koji kodira jednu subjedinicu NADPH oksidaze, tako da muškarci oboljevaju, a žene su uglavnom prenosioci) koji pokazuje značaj ROS-a u zaštiti od mnogih tipova bakterijskih infekcija. Osobe sa ovim oboljenjem teško se oslobadjaju bakterijskih infekcija, posebno onih izazvanih bakterijama (Saphylococci, Salmonella, E. coli, Mycobacteria) koje produkuju katalazu, tako da često dolazi do formiranja perzistentne nakupine inficiranih ćelija - granuloma.
(In June 2005, two cases of successful gene therapy for CGD were reported. Blood stem cells from the patients were removed, and the active gene for the NADPH subunit inserted into them using a retroviral vector. The transformed cells were returned to the patients, took up residence in their bone marrow, proliferated successfully, and improved their symptoms.)
OBLICI I MORFOLOGIJA ĆELIJSKOG OŠTEĆENJA
Detekcija oštećenja: 1. histohemijskim ili ultrastrukturnim metodama - min. – sati;
2. svetlosno-mikroskopski ili makroskopski -sati - dani
Reverzibilno oštećenje: Bubrenje ćelije (hidropsne promene, vakuolna degeneracija): najranije promene, bledilo organa, povećanje težine (makroskopski), male, čiste vakuole u citoplazmi, (mikroskopski). + 2 mikroskopije slajd 73 i 74.
Bubrenje ćelije (ultrastrukturne promene): evaginacije plasma membrane, gubitak jasnih granica, distorzija mikrovila; bubrenje mitohondrija, pojava amorfnih zgusnuća bogatih fosfolipidima; dilatacija endoplazminog retikuluma sa disocijacijom polizoma; disagregacija granularnih i fibrilarnih elemenata nukleusa. + 3 mikroskopije slajd 77, 78 i 79
Ćelija i okruženje
Adaptivni odgovor: atrofija, hipertrofija, hiperplazija, metaplazija. Oštećenje ćelije: reverzibilno, ireverzibilno. Delovanjem etioloških faktora - oštećenja građe subcelularnih struktura i poremećaja njihove funkcije.
Stepen oštećenja ćelije zavisi od: vrste etiološkog faktora, intenziteta i dužine njegovog dejstva, tipa ćelije (tj. od njene osetljivosti - vulnerabilnosti na dejstvo etio¬loš¬kog agensa), drugih faktora (npr. pro¬krvljenosti i nutricionih karakte¬ris¬tika zahvaćenog tkiva).
Oštećenja: biohemijska oštećenja, morfološke promene na pojedinim organelama ili u citoplazmi, mogu biti: reverzibilne ili ireverzibilne
Smrt ćelije: nekroza, apoptoza
(+ slika slajd 9)
Uzročnici oštećenja ćelije:
1. Hipoksija; 2. Fizički agensi (mehanička trauma, opekotine, smrzotine, iznenadne promene pritiska – barotrauma, zračenje, električni šok); 3. Hemijski agensi (glukoza, so, voda, otrovi – toksini, lekovi, insekticidi, herbicidi, CO, azbest, alkohol, duvan, narkotici); 4. Infektivni agensi (prioni, virusi, rikecije, bakterije, gljive, paraziti); 5. Imunske reakcije (reakcije preosetljivosti, autoimunske reak¬cije); 6. Abnrmalno nakupljanje metaboličkih produkata (npr. slobodnih radikala kiseonika);
7. Ge¬¬netske promene (kongenitalne malformacije, abnormalni proteini – hemoglobinopatije, abnor¬manost ili nedostatak enzima); 8. Nutricioni disbalans (proteinsko-kalorijske deficijencije, vitaminske deficijencije, prekomerni unos hrane – gojaznost, ateroskleroza)
Najčešća inicijalna oštećenja ćelija:
1. Integritet ćelijske membrane; 2. Aerobno disanje (promene u ATP sintezi utiču na pH, influks Ca++); 3. Sinteza proteina - smanjena sinteza proteina citoskeleta, bubrenje ćelijske (membrane);
4. Genetski aparat Npr. oštećenje DNK zračenjem: može da ostane neprimetno do deobe ćelije; prvo se vidi na ćelijama koje se brže dele). 5. Smanjena sinteza ATP u mitohondrijama - smanjena aktivnost Na+/K+ ATPaze: ćelija zadržava Na+ i H2O i bubri; nagomilava se mlečna kiselina, razvija se acidoza; lipidi se nagomilavaju u ćeliji (specijalno u ćelijama jetre izazivajući cirozu).
MEHANIZMI OŠTEĆENJA ĆELIJE
Ishemija; Reaktivni oblici kiseonika (O2.-, H2O2, OH.): radiacija; inflamacija; hemijski faktori; reperfuziono oštećenje (+sličica, slajd 15)
Ishemija i hipoksija
Reverzibilno oštećenje
Smenjena oksidativna fosforilacija:
• Smanjeno stvaranje ATP-a, a povećana koncentracija ADP-a, AMP-a i neorganskog fosfata: # AMP/ATP # aktivnosti fosfofruktokinaze # razlaganje glukoze do piruvata; Istovremeno se zbog manjka kiseonika # koncentracija NADH (izostaje njegova oksidacija u mitohondrijama) i on # prelazak piruvata u laktat što, $ pH. faza brze glukolize 2min., a zatim faza spore glukolize zbog inhibitornog delovanja niskog pH i NADH;
• Smanjena aktivnost Na+/K+ pumpe (aku¬mu¬lacija Na+ u ćeliji, isoosmotsko zadr¬ža¬vanje vode (edem), povećana konc Ca++ u citoso¬lu, difuzija K+ iz ćelije);
• Povećana c. Ca++ u citosolu - Izvori: mito¬¬hon¬drije, ER, vanćelij¬ski. Posledice: 1. Ca++ ulazi u mitohondrije i uzrokuje stvaranje pora u mitohondrijskoj mem¬bra¬ni (perme¬abi¬litetna tranzicija). Us¬pos¬ta¬vi li se normalna oksigenacija, mito¬hon¬¬drije počinju da proizvode ATP, pore se zatvaraju i popravlja se funkcija mito¬hon¬drija, a oporavljena proizvodnja ener¬gije oporavlja i druge ćelijske funkcije; 2. Aktivacija enzima (ATPaza: ↓ATP, fosfolipaza: ↓ fosfolipidi); aktivacija en¬zi¬ma, fosfolipaze, aktivacija membranskih fosfolipaza A1 i A2: otcepljuju se masne kiseline, medju kojima je i arahidonska kiselina, arahidonska kiselina se metaboliše ciklooksigenaznim / lipo¬oksi¬genaznim putem, pri čemu nastaju slobodni radikali kiseonika (*); Aktivira se fosfolipaza C koja pokreće fosfoinozitolski glasnički put, pri čemu nastaju diacilglicerol i inozitol-trifosfat koji povećavaju koncentraciju Ca++ (delujući na prenosne mehanizme u membranama ćelije i ER), Ca++ koji se u početnoj reverzibilnoj fazi nakupio u mitohondrijama sad izlazi napolje dalje povećavajući koncentraciju Ca++; Endonukleaze: oštećenje jedarnog hromatina, proteaze: razgradnja proteina membrane i proteina citoskeleta; aktivira se enzim - proteaza koja na odredjenom mestu razlaže enzim ksantin-dehidrogenazu i prevodi ga u ksantin-oksidazu, ksantin-dehidrogenaza, pri oksidaciji hipoksantina i ksantin, prenosi elektrone i vodonik na NAD, a ksantin-oksidaza prenosi elektrone na molekulski kiseonik i tako nastaje O2-., koji u prisustvu tragova Fe++ prelazi u H2O2, a ovaj u hidroksilni radikal (OH.); u nervnim i endotelnim ćelijama: podstiče aktivnost NO sintaze, pa se povećava stvaranje NO, koji deluje citotoksično prelaskom u peroksinitritni anjon i dalje stvaranjem OH.)
Biohemijske promene: anaerobnapovećana glikoliza (deplecija glikogena, akumulacija laktata, akumulacija neorganskih fosfata, ↓ pH intracelularno);
Morfološke promene
• Odvajanje ribozoma: smanjena proteina
• Pogoršanje funkcije mitohondrija
• Povećanje permeabilnost membrane
• Disperzija citoskeleta: gubitak mikrovila,
stvaranje evaginacija ćelijske membrane
• Bubrenje mitohondrija, ER i cele ćelije.
(*) Slobodni radikali kiseonika koji nastaju tokom hipoksije u reverzibilno oštećenim ćelijama deluju kao glasničke molekule i podstiču aktivaciju sistema NF-kB (nuklearni faktor kB). Transkripcioni faktor NF-kB se nalazi u citoplazmi različitih ćelija vezan za inhibicijski molekul I-kB. Aktivacijske poru¬ke (IL-1, TNF-a, H2O2, virusi, LPS bakterija) podstiču odvajanje I-kB, a nakon toga oslobodjeni NF –kB putuje u jedro i vezuje se za pobudjivače gena koje aktivira (kortizol potiskuje aktivnost NF –kB). Geni koje NF–kB aktivira kodiraju sintezu proteina koji neposredno, ili putem posrednika, učestvuju u lokalnoj inflamatornoj reakciji i opštoj reakciji organizma na oštećenje. [centralni dogadjaj u aktivaciji endotelnih ćelija i vodijePobuda NF –kB povećanoj ekspresiji adhezivnih molekula i adheziji leukocita za endotel (aktivacijom leukocita oslobadja se velika količina slobodnih radikala)]
Ireverzibilno oštećenje:
Morfološke promene:
• Mitohondrijske promene (izražena vakuolizacija; amorfna, kalcijumom-bogata zgusnuća)
• Ekstenzivna oštećenja plazma membrane
• Prominentno bubrenje lizozoma koje vodi njihovoj rupturi i ‚‚curenju‚‚ degradativnih enzima (aktivacija kiselih intracelularnog pH, sa degradacijom ćhidrolaza zbog elijskih komponenti)
• Promene u jedru (kondenzacija – piknoza i fragmentacija – karioreksa, ili razgradnja - karioliza)
• Kontinualni gubitak ćelijskih proteina, enzima, koenzima, RNK i dr. metabolita
• „Curenje“ enzima merljivo u serumu – dijagnostički značaj (*iz ćelija srčanog mišića oslobadja se CK i troponin, * iz ćelija srčanog mišića i jetre oslobadja se AST (SGOT), *iz ćelija jetre se oslobadja ALT (SGPT), ** AST i ALT - aminotrnsferaze)
• Influks makromolekula iz intersticijuma
Mehanizam ireverzibilnog oštećenja:
Fenomeni koji karakterišu ireverzibilnost: nesposobnost reverzije disfunkcije mitohondrija; duboki poremećaji funkcije plazma membrane (jedan od glavnih faktora).
Mitohondrije: su energetske fabrike eukariotskih ćelija; Imaju dve membrane - spoljašnju i unutrašnju koja je nabrana tako da formira kriste. Enzimi koji učestvuju u ciklusu limunske kiseline (Krebsov ciklus ili TCA ciklus) su locirani u mitohondrijama; Ovi enzimi učestvuju u degradaciji razgradnih produkata proteina, šećera i masti do CO2 i H2O, pri čemu se osobadjaju visoko-energizovani elektroni koji se prenose na proteine respiratornog lanca lokalizovane na unutrašnjoj membrani, gde se njihova energija prenosi na ATP (poslednje 2 fosftne grupe ATP-a su vezane za ostatak molekule specijalnim energijom bogatim hemijskim vezama – energija pohranjena u ovim vezama oslobadja se njihovom razgradnjom za ćelijke potrebe, kao što je kretanje, izbacivanje soli, ingestija nutrijenata itd.); Ovaj proces je aeroban – zahteva kiseonik. Kiseonik je potreban da primi elektrone koji su preneti na respiratorni lanac. Elektroni se kombinuju sa kiseonikom (O2) i protonima (H+) stvarajući vodu; Ako nema kiseonika ćelija stvara ATP iz glukoze anaerobnim putem; Ovaj process je znatno manje efikasan nego aerobna glikoliza i njegov krajnji produkt - mlečna kiselina može da bude štetan po ćelije. (U trkača na duge staze mogu da se jave grčevi u mišićima zbog nedovoljnog snabdevanja kiseonikom i stvaranja velikih količina mlečne kiseline).
Plazma membrana:dvoslojna, izgradjena od fosfolipida – lipida koji čine njen unutrašnji deo i koji su povezani sa negativno naelektrisanim fosfatnim grupama koje su okrenute ka spoljašnjoj sredini i unutrašnjosti ćelije. Okružuje i štiti ćeliju i kontroliše njenu unutrašnjost tako što: 1) kontroliše ulazak vode, soli i nutritienata i 2) interreaguje sa spoljašnjom sredinom posredstvom ćelijskih receptora. Proteini su uronjeni u fosfolipidni dvosloj plazma membrane. Ovi proteini imaju obično jedan eksterni domen, transmembranski domen, i jedan citoplazmatski domen. Ovi proteini služe kao most izmedju unutrašnjosti ćelije i spoljašnje sredine. Neki od ovih proteina su receptori, koji vezuju specifične supstance iz spoljašnje sredine – ligande (receptor i ligand odgovaraju jedan drugom kao brava i ključ i kada se ligand veže za receptor emituje se signal u unutrašnjost ćelije koji može da uzrokuje nastanak promena u ćeliji omogućavajući joj da se adaptira na promene u okruženju). Neki od ovih proteina služe kao adhezivni molekuli, posredstvom kojih se medjusobno povezuju ćelije (npr., epitelne ćelije) ili se ćelije vezuju za proteine bazalne membrane (epitelne ćelije) ili strome (mezenhimske ćelije).
Potencijalni uzroci oštećenja membrane:
• Progresivan gubitak fosfolipida ćelijske membrane: aktivacija fosfolipaza; redukovana sinteza fosfolipida
• citoskeletne abnormalnosti: aktivacija proteaza, bubrenje ćelije
• toksični kiseonični radikali (naročito nakon uspostavljanja protoka krvi)
• Razgradni produkti lipida (nastali degradacijom fosfolipida) imaju detergentni efekat na membranu
• Masivni influks Ca++
+ slika slajd 46
Slobodni radikali kao medijatori oštećenja ćelije
Reaktivni oblici kiseonika (ROS)
• Molekuli kao H2O2 (5)
• Joni kao hipohloridni jon (6)
• Radikali kao hidroksilni radikal (3) – najreaktivniji
• Superoksidni anjon koji je jon i radikal (2)
Radikali – takodje poznati kao SLOBODNI RADIKALI su atomi/ klasteri atoma od kojih jedan sadrži 1 nesparen elektron u spoljašnjoj orbiti, tako da je ovakva konfiguracija izrazito nestabilna, pa brzo reaguje sa drugim molekulima ili radikalima u cilju uspostavljanja stabilne konfiguracije od 4 para elektrona u spoljašnjoj orbiti (1. za vodonik)
Slobodni radikali učestvuju u: ubijanju mikroba u fagocitima; hemijskom i radijacijskom oštećenju; toksičnom delovanju kiseonika i drugih gasova; starenju ćelije; inflamatornom oštećenju; makrofagnoj destrukciji tumora; drugim
Izvori slobodnih radikala:
• Neizbežni produkti ćelijskog disanja (neki elektroni pri prelasku na respiratorni lanac “iscure” sa glavnog puta (specijalno oni koji se prenose ubikvinonom) i odlaze direktno da redukuju molekule kiseonika u superoksidni anjon
• Nepotpuna redukcija kiseonika (ovome pogoduju hipoksija i hiperoksija)
• Reakcije katalizirane: enzimima (ksantin-oksidaza, NADPH oksidaza u neutrofilima i makrofagama i mijeloperoksidaza u neutrofilima); metalima (Fentonova reakcija)
• Metabolizam: Egzogenih molekula (CCl4 konverzija u CCl3), Endogenih molekula (sinteza prostaglandina, aktivnost citohroma P-450)
• Radioloza vode u OH. i H.
Mehanizmi oštećenja slobodnim radikalima:
1. Lipidna peroksidacija membrane (povećana permeabilnost): Dvostruke veze u polinezasićenim lipidima. Među najznačajnije efekte slobodnih radikala ubrajaju se oni koji nastaju njihovim delovanjem na masne kiseline bočnih lanaca lipida različitih membrana ćeli¬je, pre svega membrane mito¬hon¬drija (direktno eksponirana O2. nastala prili¬kom ćelijskog disanja). Na slici je pri¬ka¬zan najverovatniji sled događaja: hidro¬ksilni radikal uklanja H atom sa jednog od C atoma masne kiseline bočnog lanca lipida (prikazan samo deo lanca) formirajući jedan molekul vodonik peroksida i ostavljajući C atom sa jednim nesparenim elektronom (carbon-centred radical) koji može da reaguje sa molekulom kiseonika formirajući peroksilni radikal, koji sad može da „ukrade“ jedan H atom iz obližnjeg lanca stvarajući tako jedan novi radikal. Jedna od podmuklih karakteristika slobodnih radikala je ta što oni interreaguju sa drugim molekulima da bi postigli stabilnu konfiguraciju elektrona i tom prilikom konvertuju taj target molekul u radikal. Tako započinje lančana reakcija koja se propagira sve dok se nesretnu dva radikala, koja dajući po jedan elektron oforme kovalentnu vezu kojom se povezuju. Dva česta primera: Peroksilni radikal može da interreaguje sa: 1.) drugim peroksilnim radikalom na obližnjem bočnom lancu masnih kiselina lipida unakrsno ih vezujući kovalentnim vezama. 2.) Drugim obližnjim ugljeničnim radikalom (carbon-centred radical) unakrsno ih vezijući. U oba slučaja ovako se završava formiranje radikala, ali rezultat je taj da masne kiseline bočnog lanca membranskih lipida postaju tako izmenjene da dolazi do oštećenja membrane. Lipofuscin pigment karakterističan za ostarele ćelije verovatno nastaje ovim mehanizmom.
2. Lezije DNK (smanjena sintezaproteina). Reakcije sa timinom sa prekidima jednog lanca (proteina).
3. „Cross-linking“ proteina (oštećenja jonske pumpe, transportnih mehanizama); sulfhidrilno posredovana unakrsno vezivanje proteina
*Slobodni radikali - nestabilni, spontano degradiraju. Degradaciju ubrzavaju superoksid dismutaza (konvertuje 2 O2.- → u molekul O2 i H2O2) i katalaza (konvertuje H2O2 → O2 + H2O)
Antioksidansi
Antioksidansi mogu uklanjati slobodne radikale (vitamin C, E, flavonoidi, fenoli, karotenoid, mokraćna kiselina, koenzim Q, tiolne molekule: cistein, cistamin, metionin, glutation, ubikvinon) ili mogu blokiraju stvaranje slobodnih radikala (ceruloplazmin, feritin). I neke egzogene molekule mogu u ćeliji delovati kao antioksidansi (diferioksamin).
Smatra se da je visok nivo mokraćne kiseline odgovoran za dug život nekih reptila i ptica. Čovek takodje izlučuje mokraćnu kiselinu (nastaje u peroksizomima kao reziltat metabolizma nukleinskih kiselina, a ne proteina).
Peroksizomi su veličine lizozoma (0.5–1.5 µm), i slično lizozomima, obavijeni jednoslojnom membranom. Slični su lizozomima i jer su bogati enzimima. Za razliku od lizozoma koji nastaju od Godži aparata, peroksizom ovi nastaju od endoplazmatskog retikuluma. Enzimi i proteini peroksizoma se sintetišu u citosolu. Svaki protein sadrži jedan peroxisomal targeting signal (PTS) kojim se vezuje za receptorni molekul koji obezbedjuje ulazak proteina u peroksizom, a potom se “vraća” po novi protein. Dva PTS su identifikovana: 9-amino kiselinska sekvenca na N-terminalnom delu proteina i tripeptid na C-terminalnom delu. Svaki od ova dva PTS ima svoj receptor. Neke od funkcija peroksizoma u ćelijama jetre čoveka su: 1) Razgradnja (oksidacijom) viška masnih kiselina; 2) Razgradnja H2O2, potencijalno opasnog produkta oksidacije masnih kis; 3) Uloga u sintezi holesterola (jedan od enzima koji je uključen je HMG-CoA reduktaza, target lekova za snižavanje nivoa holesterola - statina 3) Uloga u sintezi žučnih soli; 4) Uloga u sintezi lipida koji se koriste za sintezu mijelina; 5) Uloga u razgradnji viška purina (AMP, GMP) do mokraćne kiseline.
Bolesti u čijem nastanku učestvuju slobodni radikali:
Promene u starenju; Ateroskleroza; Moždani poremećaji (Alchajmerova bolest); Kancer; Srčana miopatija; Hronični glomerulonefritis; Dijabetes; Očni poremećaji (katarakta); Inflamatorni poremećaji; Inflamatorne bolesti; Plućne bolesti (emfizem); Kožne promene (izazvane sunčanjem); Nutricioni deficiti; Radijacione povrede; Reperfuzioni sindrom; Toksična stanja.
Uloge ROS u ćeliji
U ćelijama tireoidne žlezde H2O2 je neophodan da veže atome joda za tireoglobulin u sklopu sinteze tiroksina. Makrofage i neutrofili stvaraju ROS kako bi ubile neke tipove bakterija koje unose fagocitozom: bakterija uneta u ove ćelije fagocitozom nalazi se u fagozomu, fagozom sa bakterijom se spaja sa lizozomom, subjedinice enzima NADPH oksidaze se povezuju u membrani lizozoma čime nastaje aktivni enzim koji katalizuje sintezu O2. (NADPH − 2 e- + 2O2 -> NADP+ + H+ + 2 O2−) Ova aktivnost uzrokuje veliku potrošnju kiseonika,-“respiratorna eksplozija” (engl. "respiratory burst"), SOD konvertuje O2− . u H2O2, koji ubija bakterije (sem onih koje produkuju dovoljno katalaze da se zaštite). Neutrofili (ne makrofage) takodje ubijaju fagocitovane bakterije, ali uz učešće enzima mijeloperoksidaze koji katalizuje reakciju izmedju H2O2 (nastalog iz O2− .) i hlorida kojom nastaje jak antiseptik hipohloritni jon (OCl−).
H2O2 + Cl− → HOCl (hipohlorna kiselina) + OH−
HOCl → H+ + OCl−
Hronična Granulomatozna bolest
Redak genetski poremećaj (uzrokovan defektom gena na X hromozomu koji kodira jednu subjedinicu NADPH oksidaze, tako da muškarci oboljevaju, a žene su uglavnom prenosioci) koji pokazuje značaj ROS-a u zaštiti od mnogih tipova bakterijskih infekcija. Osobe sa ovim oboljenjem teško se oslobadjaju bakterijskih infekcija, posebno onih izazvanih bakterijama (Saphylococci, Salmonella, E. coli, Mycobacteria) koje produkuju katalazu, tako da često dolazi do formiranja perzistentne nakupine inficiranih ćelija - granuloma.
(In June 2005, two cases of successful gene therapy for CGD were reported. Blood stem cells from the patients were removed, and the active gene for the NADPH subunit inserted into them using a retroviral vector. The transformed cells were returned to the patients, took up residence in their bone marrow, proliferated successfully, and improved their symptoms.)
OBLICI I MORFOLOGIJA ĆELIJSKOG OŠTEĆENJA
Detekcija oštećenja: 1. histohemijskim ili ultrastrukturnim metodama - min. – sati;
2. svetlosno-mikroskopski ili makroskopski -sati - dani
Reverzibilno oštećenje: Bubrenje ćelije (hidropsne promene, vakuolna degeneracija): najranije promene, bledilo organa, povećanje težine (makroskopski), male, čiste vakuole u citoplazmi, (mikroskopski). + 2 mikroskopije slajd 73 i 74.
Bubrenje ćelije (ultrastrukturne promene): evaginacije plasma membrane, gubitak jasnih granica, distorzija mikrovila; bubrenje mitohondrija, pojava amorfnih zgusnuća bogatih fosfolipidima; dilatacija endoplazminog retikuluma sa disocijacijom polizoma; disagregacija granularnih i fibrilarnih elemenata nukleusa. + 3 mikroskopije slajd 77, 78 i 79